Ицхок-Лейб Пастернак родился в еврейской семье содержателя гостиницы. Помимо него в семье было пять детей. В раннем детстве проявил любовь к рисованию, хотя родители поначалу не одобряли этого увлечения. С 1879 по 1881 гг. Леонид учился в одесской рисовальной школе, однако окончательно избрал карьеру художника не сразу. В 1881 г. он поступил в Московский университет и два года занимался на медицинском факультете. В 1883 г. перевёлся в Новороссийский университет (Одесса) и там учился на юридическом факультете до 1885 г. Параллельно с университетской учёбой Пастернак продолжал заниматься живописью. В 1882 г. он занимался в московской школе-студии Е. С. Сорокина. В 1921 г. Пастернак вместе с женой и дочерями уехал на лечение в Германию.
Начальное художественное образование Л. О. Пастернак получил в Одесской рисовальной школе. Позднее он успешно совмещал занятия на юридическом факультете Одесского университета и в классах мюнхенской Королевской академии художеств.
Первая серьезная картина "Письмо с родины" (1889) принесла ему известность и была приобретена П. М. Третьяковым.
В этом же году Пастернак женился, а в 1890 г. в семье родился сын Борис (в будущем известный русский писатель).
Участие в выставках, портретирование заказчиков создали художнику устойчивую репутацию хорошего рисовальщика. Он открыл в 1889 г. частную школу рисования, одну из первых в Москве, а спустя пять лет был приглашен в качестве преподавателя в МУЖВЗ.
В основе творческого метода мастера лежали быстрые, почти мгновенные зарисовки, схватывающие "самую суть изображаемого", он называл их школой "настоящего импрессионизма". Ощущение фиксации впечатления художнику удавалось сохранить и в живописных работах - за счет выбора наиболее острого момента, как бы случайного движения, раскрывающего образ ("Перед экзаменами", 1897; "Л. Н. Толстой в семье", 1901; "Студентка", "За чтением", обе 1900-е, и др.).
В 1890-е гг. Пастернаком были выполнены лучшие работы в области книжной графики: рисунки к Собранию сочинений М. Ю. Лермонтова (1891); четыре акварели к роману "Война и мир" (1893). По личному приглашению Л. Н. Толстого, в постоянном дружеском общении с великим писателем художник создавал в 1898-99 гг. иллюстрации к роману "Воскресение", остающиеся до сих пор непревзойденными.
Уже к началу века Пастернак - признанный портретист и иллюстратор, член-учредитель СРХ, с 1905 г. - академик. В ближайшие десятилетия его моделями были Л. Н. Толстой, С. В. Рахманинов, Ф. И. Шаляпин, М. Горький, после 1917 г. - Ленин, члены правительства. В 1921 г. Пастернак уехал в Германию. Здесь им были выполнены портреты А. Эйнштейна, Р. М. Рильке, Д. Осборна. Последние годы жизни (после 1939) художник провел в Англии.