Работал в Сиене и Флоренции, был записан в цех флорентийских живописцев. Среди его многочисленных работ особенно замечательны грандиозные фрески, написанные им совместно с братом между 1337 и 1339 на стенах сиенской ратуши. В Орвьето Амброджо Лоренцетти расписал фресками главную капеллу в соборе Санта Мариа. Наряду с Дуччо ди Буонинсенья и Симоне Мартини, Амброджо Лоренцетти является крупнейшим итальянским художником первой половины 14 века. Точная дата его смерти неизвестна. По одной из версий, по неподтвержденным источникам Амброджо умер в 1348 во время эпидемии чумы.